Mosaic Image Captured with SimpleXYZ Motorized Stage
iScope Microscope from Euromex
Objective 20x
Camera Euromex 6MP
Mosaic processed with Microscoft Image Composite Editor from Array of 15x15x3 total of 675 images
Mosaic Image Captured with SimpleXYZ Motorized Stage
iScope Microscope from Euromex
Objective 4x
Camera Euromex 6MP
Mosaic processed with Microscoft Image Composite Editor from Array of 15x15x3 total of 675 images
En A.COLOMA siempre hemos apoyado y defendido ( ¡y usado por supuesto!) las soluciones Open Source en software para microscopía, así también estamos utilizando dispositivos Open Hardware como impresoras para poder ofrecer a nuestros clientes soluciones que no existen en los mercados “tradicionales” y que por el elevado coste de desarrollo que conllevan las soluciones propietarias , no pueden satisfacer dichas soluciones.
Esperamos que nuestra experiencia ayude a otros a mejorar y desallorar la microscopia en nuestras fronteras tal y como nosotros en ACOLOMA Winkoms Open Microscopy hemos desarrollado y mejorado nuestros productos con la informacion de foros, como los de ImageJ , Micromanager, Python entre otros. En los próximos días iremos publicando nuevas entradas con la información.
Atentamente,
F.Xavier Gómez
Es un gran clásico que los clientes me pregunten por cámaras digitales de «cuantos más Megapíxeles mejor» Ahora bién siempre respondo lo mismo cuando me hacen esta pregunta y mi respuesta es:
El poder separador ( A.K.A. resolución) de un microscopio NO la da la cámara sino el Objetivo del microscopio
Ahora bién en el mercado existen cámaras de microscopio desde 1 hasta 32 Megapixeles , siendo habituales los 5 y 10 Megapíxeles, pero si el poder separador/resolución NO la da la cámara….
¿Cuantos píxeles son los necesarios para trabajar con microscopia?
Bueno aquí os argumentaré el motivo de mi respuesta siendo lo más “objetivo” posible.
Primer punto – El poder Separador (A.K.A. Resolución ) de un microscopio
Para determinar CUANTOS píxeles necesitamos antés debemos conocer el poder separador de nuestros microscopios.
Este parámetro viene determinado principalmente por la Apertura Numérica de nuestros objetivos y esta definido por la siguiente formula simplificada :
Form 1 Poder Separador [1]
Donde:
Tabla Poder Separador en µm
Segundo punto – Teorema de Nyquist
Ahora tenemos la resolución de nuestros objetivos, pero ¿ como se traduce eso en píxeles?
Bueno para eso tenemos el Teorema de Nyquist [2] que nos determinará el tamaño de píxel IDEAL para cada uno de nuestros objetivos. No voy a profundizar en él, para más info consultar Wikipedia 😉 .
Una formula para calcular nuestro tamaño de píxel IDEAL en microscopia es:
Form 2 Pixel Ideal [3]
Donde:
Ahora añadimos una columna a nuestra tabla de Poder Separador con la columna Píxel Ideal en µm:
Tabla Dimensiones Pixel Ideal en µm [3]
Tercer punto – Tamaño Sensor Cámara
Ahora sabemos que dimensiones deben tener nuestros píxeles para resolver con máximo detalle las imágenes de nuestros microscopios… pero ( siempre hay perossss ) ¿ como traducimos tamaño de 1 píxel a las resoluciones que manejamos con nuestras cámaras?
La forma más sencilla es:
Form 3 Dimensión Pixel Ideal
Donde consideramos que los píxeles son CUADRADOS
Para un sensor teórico con de 1” de diagonal y un formato de 4/3 obtenemos:
Tabla MegaPíxeles Máximos según aumentos
Por encima del valor MegaPíxeles obtenido estaremos sobremuestreando la imagen y NO OBTENDREMOS MÁS INFORMACIÓN sino simplemente manchas más grandes con más píxeles pero no más “resueltas”.
Por debajo del valor si que PERDEMOS INFORMACIÓN y no es recomendable en absoluto ( si lo podemos evitar claro ).
Un detalle que debemos considerar es que aquí nuestro sensor no tiene ningún elemento óptico que pueda modificar las dimensiones del sensor.
En caso que nuestro microscopio disponga de un adaptador 0,63x o 0,5x para la cámara debemos calcular el tamaño del sensor con la siguiente formula:
Form 4 Dimensión/Campo cámara
Ejemplo de Cámara 1/3” con un adaptador 0,5x:
Comparemos los resultados de los MegaPíxeles máximos con y sin adaptador:
Tabla MegaPíxeles Máximos Cámara 1/3” con adaptador 1x
Tabla MegaPíxeles Máximos Cámara 1/3” con adaptador 0,5x
Aquí vemos la doble utilidad de los adaptadores ópticos para cámaras en los microscopios ya que además de aumentar el “campo” de nuestra imagen nos permiten también obtener imágenes a mayor “Megapíxeles” ¡¡a costa de perder aumento claro!!
Nota:
Esta dimensión de píxel Ideal y todas la tablas hasta aquí presentadas , corresponden a un sensor MONOCROMO.
Los sensores RGB, que habitualmente disponen de un filtro de color con patrón Bayer, el píxel útil NO corresponde al tamaño de Píxel que suministra el fabricante por que no se considera que debemos aplicar una DeMosaicing [4]( interpolación de color ) para obtener un píxel con el color RGB correcto alterando el tamaño del píxel efectivo según el método/algoritmo de DeMosaicing que apliquemos con factores habituales entre 1.25x y 2x según el método usado.
Espero que os sea de utilidad, agradeceré cualquier comentario o corrección que podáis hacer.
Atentamente,
F.Xavier Gómez
Referencias
[1] https://en.wikipedia.org/wiki/Optical_resolution
[2] https://es.wikipedia.org/wiki/Teorema_de_muestreo_de_Nyquist-Shannon
[3] http://www.microscopyu.com/tutorials/java/digitalimaging/pixelcalculator/
[4] https://en.wikipedia.org/wiki/Demosaicing
Todo el contenido pertenece a F.Xavier Gómez se encuentra bajo una Licencia Creative Commons Atribución 3.0 Unported.
Permisos que vayan más allá de lo cubierto por esta licencia pueden encontrarse en http://acolomamicroscopis.com/portal/?page_id=14.
Todos los microscopios, por buenos que sean presentan pequeñas deficiencias en la iluminación de las muestras, esto se traduce que aún realizando el centraje del condensador correctamente, podemos tener diferencia de iluminación entre el centro de la imagen y los bordes de esta.
fonsIncorrecte
En el ImageJ existen multitud de plugins para corregir estas diferencias de iluminación. Aquí os explicaré como hacerlo con el Plugin Calculator_Plus ( http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/calculator-plus.html ).
Doy por supuesto que ya tenéis instalado el ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html ) y que habéis copiado el Plugin Calculator_Plus.class en la carpeta Plugins.
Para realizar las correcciónes de fondo aplicaremos la formula citada en la web del Calculator_Plus:
Imagen Corregida = (Imagen/Fondo)*255
El resultado es:
Fondo Corregido
Como podreis observar se ha corregido no sólo el fondo , sino también el balance de blancos. Ahora bién el “precio” que debemos pagar es una reducción del rango dinámico de la cámara. Para que el resultado sea el correcto la imagen del fondo DEBE tener la misma exposición y configuración que la imagen a corregir, esto se consigue simplemente quitando la muestra del microscopio ;-).
Aquí va un vídeo de todo el proceso en el que podréis ver que también funciona con imágenes de fluorescencia:
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